Resultados y discusión

Para determinar la concentración óptima de recubrimiento se ensayaron diferentes concentraciones de LPS Ogawa. A partir de 20 g/mL no se incrementó la absorbancia del control positivo y se alcanzó la zona de meseta, la cual se extiende hasta 40 g/mL observándose un efecto gancho en 80 g/mL, concentración en la que la señal disminuye. Decidimos trabajar con una concentración de recubrimiento de 25 g/mL para tomar un valor por encima del límite mínimo y alejado de los extremos de la zona de meseta (Fig. 1).

Figura 1 Determinación de la concentración óptima de recubrimiento.

Para determinar la dilución óptima de las muestras, se empleó saliva en diluciones sucesivas hasta 1:8. Se seleccionó como dilución óptima 1:2, donde se pudo comprobar la mayor discriminación pre y post-inoculación (Fig. 2).

Figura 2 Determinación de la dilución óptima de trabajo de las muestras de saliva

Como control positivo se empleó un suero con alto título de IgA anti LPS, por la necesidad de contar con suficiente volumen de muestra para su empleo en todos los ensayos y garantizar la reproducibilidad de los resultados en los diferentes ensayos clínicos prospectivos. Sus resultados sólo se usaron para la aceptación de las placas y no para determinar el valor de corte. Para garantizar que el comportamiento de este control fuera similar al de las muestras de saliva se probaron diferentes diluciones. La dilución de trabajo seleccionada fue 1:400, DO similar al de las muestras de saliva positivas con títulos bajos.

La mejor combinación entre los tiempos de incubación de las muestras y el conjugado fue de 2 h para las primeras y 1 h para el segundo (Fig. 3).

Figura 3 Determinación de los tiempos de incubación óptimos de las muestras y el conjugado

El valor de corte fue calculado en base a la normalización de las muestras negativas. Después de normalizadas cada una de las 110 muestras se seleccionó el mayor valor normalizado para un 100% de especificidad que fue 4.1. Con el nivel de corte seleccionado se determinaron los parámetros de control de las 170 muestras experimentales del ensayo.

Se determinó la sensibilidad, la especificidad, el VPP, el VPN y la eficiencia del ensayo comparando el ELISA con el ELISPOT, el Vibriocida y el grupo experimental. Las sensibilidades fueron 90.3, 92.y 93.3%, respectivamente. Las especificidades fueron 86.9, 89.5 y 96.0%, respectivamente. Estos resultados de sensibilidad y especificidad son elevados y se encuentran dentro de los límites reportados (17). Los VPP fueron de 95.0, 96.2 y 98.2%, respectivamente, es decir, la posibilidad de que las muestras positivas por ELISA sean verdaderas positivas, es elevada. Los VPN fueron 77.0 y 79.2 y 85.7%, respectivamente. Por último, la eficiencia del método fue 89.4, 90.2 y 94.1%, respectivamente y estos valores se encuentran dentro de límites aceptables (17).

Como puede observarse, a pesar de la alta correspondencia entre las técnicas, los mejores resultados fueron al comparar el ELISA con el grupo experimental, pues no todos los inmunizados inducen buena respuesta de anticuerpos (17-20). Por otro lado, Nuestro ensayo fue capaz de discriminar entre el grupo control (dosis 0) y los grupos con diferentes concentraciones de V. cholerae, (p< 0.05).

Con vistas a valorar si la dosis influía en la presencia de IgA específica se agruparon los datos de acuerdo al inoculo (0, 107, 108 y 109). Se observó la existencia de una respuesta dosis-dependiente donde al aumentar la concentración del inoculo aumentó la respuesta, siendo la de 109 la de mayor número de casos positivos detectados por ELISA (p < 0.05) (Fig. 4). }

Figura 4 Porcentaje de positividad según seriadamente de obtención de la Saliva

El sistema inmune mucoso se encuentra integrado, por lo que las respuestas inducidas en las placas de Peyer pueden ser evaluadas a distancia como, por ejemplo, en la saliva. Esta muestra es fácil de obtener y proviene, fundamentalmente de las parótidas, si el método de obtención es por masticación (16,18). Además, para evitar la acción de las proteasas de esta secreción se puede trabajar inmediatamente a temperaturas bajas o realizar la inactivación de las mismas (19). Los intentos de detección de IgA en saliva en vacunas de Cólera no han tenido resultados totalmente satisfactorios, pues en algunos casos los tiempos de toma de las muestras han sido muy espaciados (semanal) (20-22).

La aparición de IgA en saliva la detectamos a los siete días (primer día evaluado) después de administrar por vía oral el candidato vacunal, apreciando aumentos progresivos a los ocho y nueve días, declinando la respuesta a los diez hasta desaparecer a los catorce días (Fig. 4). Esto pudiera explicar la negatividad observada en ocasiones en otros ensayos (22-25).

Conociendo que existen mecanismos de recirculación linfocitaria y un sistema de mucosas común, estas células B IgA+ específicas pueden abandonar las placas de Peyer y ganglios linfáticos regionales, recirculando por la sangre periférica y colonizando la lámina propia y otros sitios efectores. La marcada disminución a los catorce días pudiera estar ocasionada por la menor migración de linfocitos B a la mucosa bucal, con relación a los que se dirigen al intestino, donde se produjo la colonización o porque las células plasmáticas, las cuales arriben a la mucosa bucal, comiencen a dejar de producir IgA, pues los plasmocitos son células terminales (26).

En resumen, el ELISA desarrollado permitió la detección de la IgA anti-LPS en saliva con una alta sensibilidad, especificidad y valores predictivos. La aparición de la IgA siguió una adecuada cinética y fue dosis dependiente. Resultados que pueden ser extrapolados a la evaluación de otras vacunas mucosales.